刀马旦国语以民国初年为背景，当时军阀割据、时局动荡，百姓生活困苦。一张不慎流落民间的藏宝图，吸引了袁世凯麾下督军、日本特务以及革命党人等多方势力暗中追查。南方政府特务沈玉茹由周慧敏饰演，为查明藏宝图的下落而乔装潜入戏班。各方争夺藏宝图期间，她亲眼目睹父亲遭人枪杀，悲痛之下意外失足，并因此失去记忆，随后流落街头。
小四喜坤班师傅沈铁兰由罗乐林饰演，带领戏班返回北平时救下了玉茹，将她收为徒弟，并替她改名沈菊仙。菊仙与师姐尚菊笙由梁佩玲饰演、张菊秋由许秋怡饰演、阮菊玲由何美钿饰演成为同门师姐妹，但几位师姐对她抱有成见，处处排挤刁难。一次意外中，菊笙爱上了富家少爷乔浩光，而浩光却早已对菊仙一见钟情，令两姐妹之间的矛盾进一步加深。
后来，菊仙得到当时花旦名角梅芷苓由罗文饰演以及高一鸣由盖鸣晖饰演的提携，终于与众师姐妹一起让令女京戏班扬眉吐气。与此同时，她也逐渐开始恢复失去的往日记忆。
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