《一个都不能少》讲述了水泉小学唯一的老师高老师因家中有事暂时请假，只好由村长从邻村找来年仅十三四岁的女孩魏敏芝代课。高老师虽然担心她年纪太小，但由于找人不易，还是嘱咐她每天带学生抄课文，并仔细清点人数，一个都不能少。
水泉小学原本有三十多名学生，却因一些家庭无力承担费用，最后只剩下二十六人。学生们嫌魏敏芝年纪小、不像老师，便故意捣乱，让课堂变得一片嘈杂。学生张慧科家境贫困，母亲又卧病在床，只得进城打工挣钱。得知这一情况后，魏敏芝号召同学们一起凑钱，决心进城把他找回来。
抵达城市后，魏敏芝经历了不少艰辛，最终在好心人的帮助下找到了张慧科。与此同时，这群来自山区的孩子也因此获得了社会的广泛关注。
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