《护国良相狄仁杰之京都疑云》讲述了圣历年间发生在武周朝的一场惊天阴谋。武则天凭借卓越的谋略将国家治理得国泰民安，但李、武两家围绕皇权的争斗始终暗流涌动。一天深夜，侍奉武则天多年的贴身宫女阿香突然行刺女皇，失败后当场被杀。武则天并不相信阿香就是幕后真凶，随即下旨命大理寺彻查此案。然而案件刚刚展开，御医徐大夫便吊死在房中，阿香的尸体也离奇失踪，局势顿时变得更加诡谲。
此时，早已辞官归乡的狄仁杰正与乔泰、马荣忙着为随从陶甘操办婚事。太原知府计中突然来到狄村，指认陶甘和马荣杀害了京城派来的信使。武则天迟迟得不到狄仁杰的消息，只得假称身体有恙，将朝政暂时交给儿子李哲和侄子武三思处理，自己带着上官婉儿及男宠张昌宗离开京城，踏上寻找狄仁杰的道路。一路上，她屡遭追杀，历尽艰险来到狄村，却被人设局，得知有人诬称狄仁杰正是谋害女皇的幕后之人。
深知狄仁杰为人的武则天很快看穿了其中的阴谋。狄府彻夜长谈后，君臣二人都意识到，连环案件背后隐藏着一个极其阴险的对手。面对危局，狄仁杰接受武则天的任命，重新查办此案。次日为女皇接风的宴席上，忠厚的乔泰突然发疯，武则天也险些在混乱中遇害。经过一番血腥厮杀，狄仁杰发现陶甘的新娘东方雨竟是对手派来的杀手，并借助计谋引出了策划这一连串谋杀的元凶——太原知府计中。
然而，审问计中时，狄仁杰又察觉到案件中仍有疑点。自负的武则天却坚持立即处死计中，并决定返回京城。狄仁杰无法惊动官府，只能组织村民护送女皇启程。途中，武则天与上官婉儿遭到劫持，狄仁杰为护驾负伤，女皇遇害的消息也随之传回京城，朝廷顿时陷入混乱。
张昌宗携圣旨回到京城，要求太子李哲将权力交给武三思；上官婉儿则现身太子府，亲口揭穿张昌宗假传圣旨、
