五号特工组2中，马云飞与高寒举行婚礼当天，老朋友老于突然现身，请求他们再次出山，追查盗窃美国核武器资料的双料间谍吉川猛夫。高寒不得不成为落跑新娘，跟随欧阳剑平、李智博前往云南接受任务，马云飞和何坚也相继重返前线。语言专家欧阳剑平、爆破专家李智博、特工马云飞、密码专家高寒和神偷何坚五人再次集结，组成五号特工组。
与此同时，日本方面派出更加狠辣的高级女间谍酒井朝香。她是酒井美惠子的亲妹妹，手段比姐姐更为毒辣凶狠。五号特工组刚刚展开行动，便遭到吉川猛夫隐藏同伙的陷害，被关进监狱。无奈之下，五人集体越狱，一边躲避美军追捕，一边继续追踪吉川猛夫，最终揪出美军内部的叛徒，并抢在酒井朝香之前找回失窃的核武器资料。
随着战事不断升级，前线士兵出现大规模病毒感染，五号特工组奉命展开调查。没想到调查途中，他们与这场病毒战的幕后祸首桥本失之交臂……
