一门三司令讲述了抗日战争时期国共合作背景下，江东杨氏三兄弟在家国危局中的生死抉择与恩怨纠葛。杨家一门忠烈，四百年前曾有四十七人为抗击倭寇战死，明朝御旨为其修建三座石牌坊。到了抗战年代，杨家三兄弟依然身处风云中心：长兄杨天东是八路军蟒山纵队司令，活跃在汉江一带；二弟杨天伯担任国民党江东城防副司令，后接任城防司令；幼弟杨天鸿原为江东城防司令钱国栋的侍卫长，后来成为特别行动队队长。
1944年，国共双方决定在江东实施盾牌行动，牵制日军池田旅团，阻止其增援太平洋战场。重庆派盟军代表汤姆逊和国防部机要参谋林娜前往江东，负责传达行动方案并协调各方。林娜是宪兵队长罗云的妻子。两人尚未完成任务，钱国栋便在前往接洽途中遭到袭击，卫兵全部战死，钱国栋也当场身亡；与此同时，汤姆逊和林娜被日军特遣队劫持。
日军特遣队在江东内奸鹰眼提供的情报协助下，故意制造杨天鸿与人斗殴的假象，借机刺杀钱国栋并绑走汤姆逊、林娜。由于杨天鸿当时擅离职守，又在饭局上与人发生冲突，罗云将他视为重大嫌疑人并予以逮捕。日军随后乔装成奔丧队伍，把林娜藏在棺材中企图运出城外。罗云虽然识破阴谋，却在追捕过程中误伤了前来参加盾牌行动会晤的杨天东。
杨天东伤势严重，因血型特殊，只有有血缘关系的人才可能为他输血。罗云为了换取城防部队出兵营救林娜，不得不释放杨天鸿。此时，日军又潜入医院企图杀害杨天东，妄图激化国共矛盾、破坏盾牌行动。重庆与延安对此高度重视，并派耿娟打入宪兵队，协助
