《绞杀1943》将故事置于1943年的抗日战争时期。战争虽已接近尾声，却正处在最为艰苦的阶段。国民党方面派出精锐特种部队“猛虎队”潜入一处日军基地，却落入敌人设下的埋伏，最终全员牺牲。消息传出后，国民党高层震动不已，没过多久，连潜伏在日军内部、代号为003的特工也遭到截杀。为查清内部奸细，高层下达密令，派军统中校军官周志卿（车永莉 饰）深入敌后，追查事件真相。
与此同时，周志卿的姐姐至柔（陆玲 饰）还有另一重身份。她是牺牲的“猛虎队”队长尤龙的妻子，也是中共高级特工，代号“延河一号”。国仇与家恨交织在一起，促使她踏上追查杀害丈夫凶手的道路。面对藏身暗处、阴险狠辣且手段残酷的敌人，姐妹二人将迎来一场充满危机与挑战的较量。
