《党员马大姐》讲述了退休后的马大姐重新寻找人生价值，并在曲折经历中接受考验、最终加入中国共产党的故事。
马大姐原单位的一位老姐妹在退休前光荣入党，特意将这个喜讯告诉她。两人当年同期参加工作，还一起写过第一份入党申请书。马大姐既替老姐妹高兴，又因自己提前退休而感到失落，认为政治生命也随之早早结束，像自己这样的闲人再也没有资格谈入党。正当她因此闷闷不乐时，街道办事处通知她前去开会。
原来，街道新开了一家便民小旅馆，却一直找不到合适的负责人。考虑到马大姐退休前曾在国务院招待所工作多年，街道决定聘请她临时代理旅馆负责人。得知自己还有机会为社会做贡献，马大姐十分振奋，认为可以在新的岗位上接受组织考验，入党仍有希望，于是在上任前一晚郑重写下了入党申请书。
然而，旅馆刚开始试营业便麻烦不断，马大姐疲于应付，还得罪了不少想来占便宜的老邻居。更让她意想不到的是，街道办事处会计老徐原本很想当旅馆经理，如今却只能接受上级委派，定期前来进行财务督察。老徐表面上热心为马大姐出谋划策，暗地里却不断寻找她的错处，企图抓住把柄取而代之。马大姐却把他当成知心人，对他毫无防备。
街道领导提醒马大姐，工作中必须讲政策、讲原则，否则会影响她成为入党发展对象。她一度动摇，甚至开始疏远三姐，但最终意识到，真正的入党首先是思想上的入党，于是咬牙坚持下来。一次素质训练意外取得成功，马大姐因此受到社会各界关注和赞扬，三姐也被一所学校免费录取，她与马大姐的合影还登上了报纸。
随后，马大姐试图旁敲侧击地向老徐了解一些往事。老徐起初满怀戒心，后来更认定马大姐来者不善，想方设法躲避她。直到真相揭开，老徐才知道三姐竟是自己失散多年的女儿，既惭愧又不敢面对她。马大姐不计前嫌，答应慢慢做三姐的工作，促成父女相认。可是三姐无法接受这个事实，尤其得知自己的父亲竟是自己最讨厌的老徐后，更加抵触。她提出，认父亲的先决条件是老徐
