祠堂是家族的圣地，在男尊女卑的时代，却也是女人不得踏入的禁地。《大祠堂》的故事，正是从一个女人开始，在家族、宗族与时代的风云变幻中展开，最终走向难以预料的结局。
明朝末年，徽州府临源谢家有一座象征兄弟和睦、宗族团结的祖祠悌让堂。前谢家长孙谢致卿与后谢家长孙谢致成同祖不同宗，却一同在祠堂举行新婚大典。婚礼喧闹之际，祠门突然倒塌，致卿被砸伤，喜庆的气氛也随之蒙上了一层不祥的阴影。
戏班班主郑芝盟的女儿郑秀云，自幼与谢致成青梅竹马，却阴差阳错嫁给了谢致卿。新婚不久，致卿便与致成结伴外出经商，秀云由此开始了徽州女人“一世夫妻三年半”的漫长等待。
以秀云公公秀才为代表的前谢，与以三爷为首的后谢，长期围绕悌让堂的掌祠权明争暗斗。秀才屡试不第，便把光宗耀祖的希望寄托在被乡邻视为神童的小儿子谢致相身上；三爷虽有三个儿子，却仍将长房长孙谢致成视为家族栋梁，倾力栽培。随着后谢三爷的三儿子谢格非中举，两谢之间的较量逐渐白热化。
为了调解两族纷争，秀才请来秀云的父亲郑芝盟，并希望借一出劝善戏文化解干戈。不料戏班演出期间，秀云的小姑子玉芬竟与戏班小生私奔，令两谢矛盾进一步加深。
此后，秀云接连面对人生的重重考验。持家的重担过早落在这个年过二十的女人肩上，因病而变得极度依赖她的小叔致相，也让她难以摆脱沉重的家庭责任。被找回的玉芬因触犯族规，面临“沉江”之刑；外出八年的致卿归来时，身边带着一名姿容艳丽的小妾和一个刚学会走路的儿子；致相中举，秀才发疯，玉芬女扮男装进入
